新型冠狀病毒（2019-nCoV）檢測方法介紹-核酸檢測

冠狀病毒是一類具有包膜、基因組為線性單股正鏈的RNA病毒。人體感染冠狀病毒后通常引起感冒、發燒等癥狀，嚴重者能造成死亡。2020年1月于武漢發現的新型冠狀病毒（2019-nCoV）是目前發現的第七種能夠感染人類的冠狀病毒。判定人體是否感染冠狀病毒通常有三種途徑，分別是對冠狀病毒的編碼基因（RNA）進行檢測、對冠狀病毒基因表達的特定蛋白（如Spike蛋白）進行檢測以及對冠狀病毒侵入人體后產生的IgG/IgM進行檢測。本文主要對2019-nCoV核酸檢測的原理及方法做一介紹。

檢測原理

冠狀病毒的編碼基因是RNA，通過測定樣本中是否含有新型冠狀病毒基因，即可判斷患者是否被感染。RNA檢測主要依賴于逆轉錄實時熒光PCR（RT-PCR）技術。

逆轉錄實時熒光PCR技術

PCR的全稱為聚合酶鏈式擴增技術，是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術，能夠實現微量DNA片段的大幅擴增。其基本原理是先將雙鏈DNA解鏈為單鏈，隨后以單鏈DNA為模板，借助人工合成的一段核酸片段（引物）來??? 啟動合成，最終合成新的雙鏈DNA。在PCR反應體系中，DNA雙螺旋被解鏈成單鏈后，引物與單鏈DNA的特定序列結合，形成一小段的雙鏈DNA，隨后在合適的溫度下進行延伸，形成新的雙鏈DNA。每經過一個循環，核酸數量就會增加1倍，經過28-35個循環，即可將微量的核酸片段變的肉眼可見。

由于2019-nCoV的編碼基因為RNA，因此需要先將RNA逆轉錄為cDNA，隨后進行PCR擴增，該技術稱為逆轉錄PCR。在逆轉錄PCR反應體系中加入熒光探針，隨著PCR的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，通過熒光信號，實現對逆轉錄PCR產物（DNA序列）的實時監測。

2019-nCoV序列的引物設計

核酸檢測的準確性由引物的特異性決定，引物特異性不高會導致出現非特異性擴增，最終影響測定結果。目前核酸檢測所使用的引物序列，基本都是針對病毒序列中高度保守的2至3個序列（比如編碼replicase復制酶或者necleocapsid核蛋白衣的核酸序列）來進行設計。2019-nCoV的引物序列如下圖所示：

檢測步驟

核酸檢測現主要通過檢測試劑盒實現，檢測步驟主要分為樣本采集、RNA提取及PCR擴增三部分。

樣本采集

常規的樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等，依據試劑盒說明書進行樣本的采集。獲得樣本后需盡快進行檢測。

RNA提取

利用核酸提取試劑盒對RNA進行提取，空氣中含有大量的RNA酶，RNA在空氣中極易降解，因此需做好保護措施（如加入能抑制核酸酶活性的物質）。在提取得到RNA后需立即進行PCR擴增。

PCR擴增

最后將RNA放入PCR反應體系中進行擴增，并觀察擴增結果。擴增后的核酸序列帶有熒光，如果檢測到熒光信號曲線符合病毒特征，那么就認為該疑似患者為陽性。在實際操作過程中，需對一位患者進行多次檢測

提取病毒RNA本身也包含裂解樣本，提純RNA等多個工序，需要花費數小時。而RT-PCR一般來說也需要至少三四個小時才能完成。因此整個流程預計需要一個工作日，即6-8小時左右，檢測結果都需要經過復核，重復實驗則需要花費雙倍的時間。

檢測特點

核酸檢測是分子層面上的檢測，就現有所有的快速檢測方法來看，這種方法檢測的特異性和靈敏度都是最高的。由于這一檢測方法靠的是分子層面的特異性結合，因此只要公布的基因序列沒有問題，相關技術的檢測準確率可以達到99.9%。

核酸檢測與蛋白檢測方式對比

參考文獻

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