液相色譜-串聯質譜法檢測25-羥維生素D標準化專家共識

中國老年保健醫學研究會檢驗醫學分會, 中國老年醫學學會檢驗醫學分會
中華檢驗醫學雜志, 2021, 44(7): 587-595

臨床血清維生素D檢測方法主要為化學發光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）和液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography- tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）。從檢測原理出發，LC-MS/MS是基于被測生物標志物本身分子量、結構等化學性質的直接分析法，因此具有獨特高靈敏度、高特異性和高通量特點。CLIA是基于抗原抗體反應，與LC-MS/MS相較，前處理簡單且檢測自動化程度高，但存在特異性低、線性范圍窄和檢測結果可比性差等問題。

目前LC-MS/MS檢測25-羥維生素D［25(OH)D］的方法大多為實驗室自建方法，雖然已有多類質譜檢測試劑盒陸續上市，但方法缺乏標準化。另外，標準物質的缺乏或不適當使用、質量保證措施的不完整均可導致檢測結果的偏差甚至錯誤。LC-MS/MS檢測血清25(OH)D方法的標準化是其在臨床實驗室成功應用的必要條件，也是保證方法之間一致性和可比性的核心要素。本專家共識旨在建立標準化的血清25(OH)D檢測方法，從標準物質和內標物的選擇、儀器與試劑的準備、檢測方法注意事項、質量控制管理、人員要求及參考區間等方面提出建議。

術語及定義

1. 25(OH)D：人體血液中維生素D的主要循環形式包括25(OH)D2和25(OH)D3，其中25(OH)D3為主要存在形式，因其穩定性好，可作為評價人體維生素D水平的可靠指標。

2. 內標：加入到待測樣品中，作為測定待測組分含量的參照標準及其已知質量或含量純物質。

3. 標準物質：具有足夠均勻且穩定的特定特性物質，其特性適用于測量及標稱特性檢查的用途。

4. 有證標準物質：附有由權威機構發布文件，提供使用有效程序獲得且具有不確定度和溯源性的一個或多個特性值標準物質。

5. 定量下限（limit of quantitation， LOQ）：在規定的測量條件下，以指定的測量不確定度能測量的樣品中可被測量的最低值。

維生素D主要代謝路徑

人體維生素D主要來源于皮膚經陽光作用合成的維生素D₃，另一種來源是食物中（如經光照后的蘑菇、野生海魚等）的維生素D₂，兩者通過肝臟代謝后以2種形式存在，分別是25(OH)D₂和25(OH)D₃，雖然人體血液中超過95%的25(OH)D為25(OH)D₃，但仍存在少量25(OH)D₂，若補充外源性25(OH)D₂，則體內可檢測出濃度較高的25(OH)D₂，因此需分別對25(OH)D₂和25(OH)D₃進行定量檢測。25(OH)D在腎臟和其他組織中轉變為具有生物活性的二羥基代謝物1，25-羥基維生素D［1，25-(OH)₂D］，該物質經過維生素D結合蛋白轉運至靶器官，與維生素D受體結合，從而發揮其生理作用（圖1）。1，25-(OH)₂D在人體內的濃度低（pg/ml級別）、半衰期短，檢測難度較大，而25(OH)D因其濃度高、穩定、半衰期較長，是反映機體維生素D代謝的重要檢測指標。

圖1 維生素D代謝途徑

LC-MS/MS技術

LC-MS/MS是通過質量分析器測定帶電粒子質荷比的一種分析技術；MS/MS是將2個質量分析器由碰撞室串接起來的分析設備，即三重四極桿質譜儀。第一級質量分析器篩選出被離子化的樣本中特定質荷比的母離子，母離子進入碰撞室，通過碰撞誘導解離的方式形成碎片子離子；第二級質量分析器篩選出特異性強的定量子離子及定性子離子，子離子進入檢測器監測，最終得到目標分析物的含量。每個母離子/子離子對被稱為1個離子對，只有具有特定離子對的待測物質，才能進入檢測器。因此，MS/MS具有很好的檢測特異性。此外，質譜方法具有同時監測多離子通道多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）的獨特優勢，即使在檢測背景信號高的內源性化合物時，亦可通過同時監測2個離子碎片通道，實現待測物質的精準檢測。

關鍵質量要素

1.標準物質的選擇

具有溯源性的有證標準物質是實現量值溯源、檢測結果準確一致的重要保證。應選用國家級權威機構有的證標準物質，若不可獲得相關權威機構或國際公認的有證標準物質，則其他獲得相關國家認可委員會標準物質生產者認可的提供明確溯源途徑和測量不確定度的標準物質可作為替代選擇。

2.內標物的選擇

1）內標物的作用

內標物可用于校正基質效應以及樣本前處理、色譜分離和離子化過程引入的偏差，有助于提高定量分析的準確度和精密度。

2）推薦內標

推薦使用25(OH)D的穩定同位素標記物作為內標品，一般有：氘代或¹³C同位素內標。

3）內標物要求

內標物至少比目標分析物大3個分子量。內標物化學純度≥98%，同位素標記純度≥97%，如果低于該純度，則其未標記的化合物濃度會與25(OH)D₂或25(OH)D₃的檢測下限接近，導致檢測結果系統性偏高。必要時應對內標物純度進行測試，以避免其中含有與目標分析物共洗脫且具有相同質量數的干擾物質。

注：因25(OH)D₂-d₆[m+1]⁺(m/z 419)脫水形成的子離子(m/z 401)與25(OH)D₃的分子離子峰[m+1]⁺(m/z 401)有相同質荷比，易與25(OH)D₃特別是其異構體3-epi-25(OH)D₃檢測發生干擾，一般建議在使用氘代內標時選用25(OH)D₂-d₃作為內標。

3.樣本前處理方法的選擇

生物樣本分析的主要障礙包括濃度低、干擾大、個體差異大等，樣品處理目的主要是去除樣品中的雜質，富集樣品。針對血清25(OH)D的檢測，如果儀器靈敏度高，蛋白沉淀法可作為首選的樣品處理方法，具有耗時少，簡單、經濟等優點，但需要進行適當的色譜分離，以減少基質效應。固液萃取（solid liquid extraction， SLE）和固相萃取法（solid phase extraction， SPE）雖然可以去除樣品的基質及富集樣品，但其洗脫效率容易受到洗脫耗材批次差異的影響，需要進行不同廠家及不同批次的比對。

4.色譜條件選擇

根據被測化合物的特性，進行流動相的優化，盡量避免使用非揮發性鹽、無機酸、表面活性劑等流動相添加劑，盡量不用或少用極低濃度（< 0.02%）的流動相添加劑。此外，25(OH)D₃與3-epi-25-羥基維生素D₃［3-epi-25(OH)D₃］為同分異構體。在學齡兒童體內，3-epi-25(OH)D₃占25(OH)D的2.5%~17%，在出生后前3個月嬰兒體內，3-epi-25(OH)D₃濃度較高，占25(OH)D濃度的60%，在成人中占比較低，偶爾可高達22%。25(OH)D₃與3-epi-25(OH)D3質荷比一致，導致無法通過質譜直接分離，一般可通過色譜分離的方式使這2種分析物具有不同保留時間；當分離度達到1.5時，可忽略3-epi-25(OH)D₃對25(OH)D₃檢測的影響。如果需要進行3-epi-25(OH)D₃的分離，則需確保色譜條件可以實現其與25(OH)D₃的基線分離，參考譜圖見圖2。

圖2 25(OH)D2和25(OH)D3檢測色譜圖

5.質譜參數選擇

LC-MS/MS定量分析推薦一個分析物使用2個離子通道，分別作為定量離子通道和定性離子通道。25(OH)D₂和25(OH)D₃是水解代謝產物，熱不穩定及離子化過程中也容易形成脫水子離子。需要注意的是其在基質中的背景噪音偏高，應避免選擇脫水的子離子碎片（即母離子減少18的碎片離子）。但如果大氣壓化學電離源作為離子化模式，其在離子源中完全脫水形成穩定的脫水離子可以作為母離子。在任何給定時間內監測到的離子對通道越多，單個色譜峰可采集到的數據點就越少，如果用于表征色譜峰面積的數據點數量不足，數據的可靠性可能會受到影響，掃描時間單個色譜峰包含至少10個（建議15～20個）數據點。此外，優化離子通道內延遲時間，以避免碎片離子間發生交叉干擾。初步確定碰撞池電壓和碰撞池能量后，建議使用提取樣本進樣以獲得基質樣本中最佳信噪比的碎片離子。

25(OH)D檢測

1.試劑

（1）二類25-羥維生素D檢測試劑盒：可溯源至可獲得的最高級別標準物質。

（2）標準曲線：建議25(OH)D2的標準曲線范圍至少包含2～100 ng/mL區間，25(OH)D₃的標準曲線范圍至少包含5～250 ng/mL區間，并且在選定的標準曲線范圍內一般分散設置4～5個濃度點。

（3）質控樣本：單獨配制質控樣本的初級工作液。質控樣本基質應盡量和患者樣本基質保持一致，以減小樣本處理和離子化中的基質效應。建議配制2～3個濃度質控樣本，濃度范圍建議在臨床參考區間的基礎上（分布于正常和異常參考區間），結合分析方法的標準曲線綜合設定，通常為標準曲線中3倍左右的LOQ、中間濃度±20%和70%～80%的定量上限，以確保不同濃度未知樣本的準確性。

2.樣本要求

本方法適用于新鮮、冷凍或凍干血清樣本的25(OH)D₂和25(OH)D₃濃度檢測。

3.參考區間

注：“-”表示引文中無此項內容。

4.報告發布

根據《GB/T 22576.1-2018/ISO 15189：2012》進行檢測結果的報告發布，報告前綜合評估：質控是否在控，與此前結果是否一致，樣本質量等因素進行綜合考量。此外，建議各實驗室報告單上分別顯示25(OH)D2、25(OH)D3和25(OH)D的含量。

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