化學發光免疫分析——磁珠性質與應用
化學發光免疫分析（CLIA）以高靈敏度聞名，可在低濃度下檢測分析物，在寬動態范圍內提供良好檢測限。免疫磁珠（Immunomagnetic Bead，IMB）具有操作簡便、分離效率高、比表面積大及物理穩定性良好的優點，是一種性能優良的磁性分離載體，是純化、檢測和定量分析復雜分析物的通用工具。磁珠作為固相載體與CLIA相結合，在外加磁場的作用下，能夠快速與底物液相分離，磁珠以其高效分離和富集作用在免疫分析反應中使抗原對磁珠上固定化抗體的影響顯著降低。
磁珠作為免疫反應和信號收集載體的優勢：
1）磁珠比表面積大，能結合更多的蛋白分子，可提高檢測范圍。
2）磁珠表面化學基團與蛋白形成共價偶聯，相對于物理吸附更牢固，更穩定。
3）磁珠均勻懸浮于反應溶液中，大大增加與樣本中待測物接觸面積，減少反應所需的樣本量，同時更快達到反應動態平衡，加快反應速度，節省反應時間。
4）將連有多種捕獲蛋白的磁珠與多標記技術聯合應用，實現同一樣本中多個待測物同時檢測，實現全自動個體化檢測。
1.磁珠種類及結構
1.1 常見磁珠種類
1）羧基磁珠（Carboxyl Mag）
Carboxyl羧基磁珠是一種化學發光試劑用高性能磁珠，羧基官能團用于蛋白或核酸偶聯，在酶免測定、免疫沉降、蛋白質印記解析時能夠發揮突出性能。
2）甲苯磺酰基磁珠（Tosyl Mag）
因磁珠涂層中含有甲苯磺酰基，含有氨基的抗體等分子無需羧合劑，可直接以化學結合的方式固定在磁珠表面
3）鏈霉親和素磁珠（Streptavidin Mag）
磁珠偶聯鏈霉親和素能對生物素標記的分子進行高純度的特異性吸收，且磁珠表面親水性聚合物涂層不會對酶促反應、PCR核酸擴增產生影響。
1.2 結構
磁珠結構一般由磁性內核、包裹在外的高分子涂層及功能基層構成。在外部磁場作用下，磁珠在磁場中做定向運動，輔以微控制和檢測手段，可實現磁珠定位和介質分離。
Fig 1. 磁珠結構（圖片參照文獻Aptamer-Modified Magnetic Beads in Biosensing）
1）內核：主要由純金屬（如鈷、鎳和鐵）或其氧化物等磁性材料組成，此外還可采用CoPt3、FeCo和FePt等磁性材料。
2）高分子涂層：材料一般為聚苯乙烯、聚氯乙烯，主要用于穩定新形成的磁珠表面和防止磁珠聚集。高分子涂層可以與多種活性物質結合，如抗原、抗體、核酸等。
3）功能基層
蛋白質或抗體偶聯磁珠表面的穩定性主要取決于表面性質。當磁珠表面無修飾時，抗體通過疏水相互作用被動吸附到磁珠表面。這種方式不能控制附著分子的最終方向，也無法保證捕獲分子的特異性和穩定性。為確保偶聯穩定性與捕獲特異性，可選擇化學修飾表面與生物修飾表面。
化學修飾表面：
-
① 經典化學修飾表面：抗原或抗體直接被動吸附于化學修飾磁珠表面。活性基團利用磁珠的表面積為抗原或抗體提供大量位點，使其與磁珠共價連接。添加到表面的經典基團有羧基、氨基、羥基和硫酸鹽。
Table 1. 磁珠經典化學修飾及活化方式磁珠化學修飾 活化方式 羧基修飾 添加碳二亞胺（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）
或磺基NHS和乙基（二甲氨基丙基）進行活化氨基修飾 激活蛋白質表面羧基 羥基修飾 在非水溶液中活化，以避免中間體水解 -
② 預活化修飾表面：分子連接到表面預活化修飾磁珠之前無需進行初步激活，在適宜緩沖液、pH和溫度條件下即可形成穩定共價偶聯。
Table 2. 磁珠預活化修飾及結合基團磁珠預活化修飾 結合基團 甲苯磺酰基（Tosyl）修飾 中性pH值：結合蛋白質巰基；
偏堿性pH值：結合氨基。環氧基團修飾 pH值稍偏堿性：結合硫醇基團；
較高pH值：結合氨基；
強堿性pH值：結合含羥基的配體。氯甲基修飾 室溫中性pH值：結合氨基
生物修飾表面（表面生物功能化）：
生物功能化磁珠由于其超順磁性被廣泛用于捕獲特定分子或細胞。生物修飾與化學修飾不同，生物修飾以非共價方式連接分子。在生物技術領域生物功能化磁珠通常用于蛋白質/分子純化等分離過程，在體外診斷試劑中作為固相載體。
- ① 蛋白A或G以非常高的親和力結合某些免疫球蛋白亞型。蛋白A結合大多數Ig的Fc區，蛋白G結合Ig的Fc或Fab區，可用于固定抗體；
- ② 鏈霉親和素具有極高親和力，鏈霉親和素與生物素之間的結合可承受高溫、大范圍pH值等極端條件。
| 功能基層 | 作用方式 | 優點 | 缺點 |
| 無 | 磁珠與抗體被動偶聯 | 便宜 | 易出現大量非特異性結合，產生高背景值 |
| 化學修飾 | 磁珠通過表面-COOH、-NH2、 -OH、-SH等化學修飾基團與抗體共價偶聯 |
表面修飾簡單，偶聯穩定 | 易出現聚合和非特異性結合 |
| 生物修飾 | 磁珠通過表面鏈霉親和素、抗IgG、蛋白A或G等生物修飾與抗體非共價偶聯 | 生物磁分離，無需額外洗滌；可承受高溫等極端條件 | 價格昂貴 |
2.免疫磁珠作用原理及應用
2.1 原理
磁珠一般具有超順磁性，在磁場作用下實現結合、未結合蛋白快速分離，簡化操作，縮短反應時間。磁珠表面通過外部修飾的功能基團結合活性蛋白，作為抗原抗體反應的載體。磁珠作用方式分為直接作用和間接作用兩種，直接作用是用抗體/抗原包被磁珠直接與特異性抗原/抗體物質結合后，形成磁珠-免疫復合物。間接作用是用二抗包被磁珠，抗原與一抗進行孵育，再加入二抗偶聯的磁珠，形成磁珠-二抗-一抗-抗原復合物。復合物具有強磁響應性，在磁力的作用下定向移動，使復合物與液體中其他物質分離，達到分離、濃縮、純化特異性蛋白的目的。
Fig 2. 磁珠作用原理
2.2 應用
免疫磁珠固相化抗原或抗體在免疫檢測、細胞分離、生物大分子純化、分子生物學等方面得到了廣泛應用。免疫磁珠還可用于臨床靶向藥物遞送、磁共振成像和細胞間熱療靶向破壞腫瘤。
1）免疫檢測
在免疫檢測中，免疫磁珠作為固相載體，抗體與抗原在磁珠上特異性結合，形成抗原-抗體復合物，在磁力作用下，使特異性抗原與其它物質分離。這種次磁性分離具有靈敏度高、檢測速度快、特異性高、重復性好等優點。磁珠還可通過極性現象來檢測表面分子、判斷細胞類型，可用于激素、神經遞質、細胞因子、腫瘤相關抗原等物質的檢測。
2）細胞分離
運用磁珠和抗體可在磁場作用下進行細胞分離，廣泛應用于：
- ① 體液中少量腫瘤細胞檢測，提高腫瘤早期診斷率；
- ② 快速高效分離T、B細胞，用于器官移植中HLA組織分型；
- ③ 骨髓移植物的預處理，提高移植成功率；
- ④ 各種醫療、科研項目特定細胞成分的分離或清除。
3）生物純化
磁珠可作為微型配基載體，在基質上固相化抗原或抗體，形成特異性吸附，再進行磁性親和抽提，不需離心和過濾。可用于分離純化大分子、DNA、RNA、DNA結合蛋白、mRNA等物質。
4）分子生物學應用
磁珠借助親和素-生物素系統可與非蛋白質結合，用磁珠固相分離單鏈法，可直接對PCR雙鏈產物進行分離或對其單鏈進行測序。
參考文獻
[1]Laborie, Etienne, et al. Analytical methods of antibody surface coverage and orientation on bio-functionalized magnetic beads: application to immunocapture of TNF-α[J].?Analytical and bioanalytical chemistry, 2021, 413(25) : 6425-6434.
[2]Philippova, O., Barabanova, A., Molchanov, V., et al. Magnetic polymer beads: Recent trends and developments in synthetic design and applications[J].?Eur. Polym., 2011, (47): 542-559.
[3]Dezfouli M, Vickovic S, Iglesias MJ, et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale[J].?Proteomics, 2014, 14(1): 14-18.
[4]Modh H, Scheper T, Walter JG. Aptamer-Modified Magnetic Beads in Biosensing[J].?Sensors (Basel), 2018, 18(4): 1041.?
[5]張宏偉, 鄭玉梅. 免疫磁珠性質及其應用[J]. 國外醫學:免疫學分冊, 2000.
[6]于露, 孫秀蘭. 免疫磁珠技術研究進展[J]. 糧食與油脂, 2011(10): 3.
相關產品
蘇公網安備32011202001302