從基因&蛋白組學(xué)水平分析猴痘ⅠB進(jìn)化支對(duì)MPXV檢測(cè)的影響

2022年，猴痘病毒（MPXV）Ⅱ進(jìn)化支在全球爆發(fā)，傳播到111個(gè)以上此前未報(bào)告病例的國家，主要影響歐洲和美洲的男同性戀群體。在接下來的一年里，非洲的MPOXⅠ進(jìn)化支病例數(shù)量激增，截至2024年6月，剛果民主共和國26個(gè)省中的25個(gè)省報(bào)告了2萬多例病例和1000例死亡。最近發(fā)現(xiàn)，部分原因是由于2023年9月始于南基伍省卡米圖加（Kamituga）市另一種猴痘暴發(fā)。由高度分化的MPXVⅠ進(jìn)化支引起，現(xiàn)在被指定為Ⅰb進(jìn)化支。

1.Ⅰb進(jìn)化支與其他進(jìn)化支有何不同

1.1 傳播方式

猴痘進(jìn)化分支直接決定了的傳播途徑及感染相關(guān)的癥狀。MPXVⅠ和Ⅱa進(jìn)化支很少在人與人之間傳播，主要由嚙齒動(dòng)物和小型哺乳動(dòng)物通過人畜共患傳播，而Ⅱb進(jìn)化支則通過與受感染個(gè)體的性接觸和非性接觸在人與人之間有效傳播。在提出的Kamituga Ⅰ進(jìn)化支暴發(fā)之前，很少有MPXVⅠ進(jìn)化支人際傳播病例的記錄；而在Kamituga市發(fā)現(xiàn)的Ⅰb進(jìn)化支主要通過與感染個(gè)體的異性性接觸傳播，且觀察到廣泛年齡范圍（包括兒童）的社區(qū)傳播。Ⅰb進(jìn)化支人與人之間的傳播方式，可能更容易造成社區(qū)層面的傳播。

1.2 基因序列

為了鑒定Kamituga暴發(fā)期間MPXV基因組的突變，以全基因組方式對(duì)參考基因組（NC_003310.1）進(jìn)行了定位。猴痘病毒Ⅰb進(jìn)化支RNA全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，Kamituga序列與其他Ⅰ進(jìn)化支成員的分離可能是由于大量的移碼突變、插入和缺失。研究人員獲得的6個(gè)Ⅰb進(jìn)化支樣本平均存在201.5個(gè)SNP、28個(gè)插入、81個(gè)缺失（deletion）、2個(gè)缺失（indel）、311.5個(gè)總突變、158.3個(gè)氨基酸替換、81.66個(gè)基因間突變、72.16個(gè)同義突變、106個(gè)錯(cuò)義突變、41.16個(gè)移碼突變和3.33個(gè)框內(nèi)缺失。通過在蛋白質(zhì)組水平上對(duì)Kamituga MPXV序列進(jìn)行突變定位，觀察到在這些突變中，包括C9L（OPG047）、I4L（OPG080）、L6R（OPG105）、A17L（OPG143）、A25R（OPG151）、A28L（OPG153）和B21R（OPG210）在內(nèi)的7個(gè)蛋白為突變熱點(diǎn)，出現(xiàn)了許多一致的框內(nèi)缺失、移碼突變、同義突變和氨基酸替換。在6個(gè)樣本中還發(fā)現(xiàn)了D14L（OPG032）基因共同缺失，以及在參考基因組中不存的14個(gè)獨(dú)特基因D2L、D4L、D17L、D18L、C3L、A26L、A27L、A48R、B15L、B1R、B18R、K1R、R1R和N2R[1]。

圖1. Kamituga MPXV ⅠB進(jìn)化支突變圖譜

注：基于參考MPXVⅠ進(jìn)化支基因組（ID:NC_003310）的結(jié)構(gòu)示意圖基因名稱和位置，根據(jù)正痘病毒基因命名法（如OPG001）和更新的MPXV RefSeq（J1L）注釋繪制。基因的取向反映在箭頭上。紅色、藍(lán)色和粉紅色字分別表示錯(cuò)義、同義和蛋白質(zhì)改變的突變名稱。紅色圓圈表示框內(nèi)缺失突變，藍(lán)色矩形表示移碼突變。每個(gè)頂部有一個(gè)圓圈的黑線表示EBI定義的新功能/稀有功能?；蚋鶕?jù)其生物學(xué)功能用顏色區(qū)分。綠色：參與免疫調(diào)節(jié)，橙色：轉(zhuǎn)錄，紫色：病毒復(fù)制/修復(fù)，黃色：細(xì)胞進(jìn)入/附著，粉色：形態(tài)發(fā)生；深藍(lán)色：毒力；淺藍(lán)色：細(xì)胞間融合，黑色：假設(shè)的基因，淺黃色：未知的基因。被刪除的Ⅰ進(jìn)化支特異性O(shè)PG032基因用紅色箭頭表示。

1.3 突變熱點(diǎn)蛋白

1.3.1 C9L（OPG047）

猴痘中的C9L基因編碼一種Kelch樣蛋白，該蛋白作為先天免疫反應(yīng)的拮抗劑發(fā)揮重要作用。C9L是MPXV基因組中唯一的Kelch樣蛋白，而其他正痘病毒含有多種Kelch樣蛋白。C9L基因在正痘病毒中高度保守。在VACV中，C9L在感染早期表達(dá)，并作為Ⅰ型干擾素反應(yīng)拮抗劑，編碼一種錨蛋白重復(fù)蛋白/F-box蛋白，該蛋白在感染VACV的人細(xì)胞中顯示干擾抗病毒活性。MPXV C9L基因含有RNA Gquadraplex（RG4），該基因在基因組進(jìn)化后易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化（不穩(wěn)定性）。在MPXV中，就像VACV一樣，C9L蛋白被認(rèn)為可以抑制宿主的先天免疫反應(yīng)，但還需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。有人提出，在2022年全球爆發(fā)期間測(cè)序的猴痘基因組包含最不穩(wěn)定的RG4結(jié)構(gòu)（即C9L-RG4-5），C9L的變異性可能驅(qū)動(dòng)病毒的傳播。在MPXVⅠB進(jìn)化支中C9L具有一個(gè)框內(nèi)缺失（DGMG483-486E）和一個(gè)移碼突變（D483X），具有三個(gè)一致的氨基酸替換（L151H，V127E和Y114N）。與V亞群（JX878417）相比，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有獨(dú)特的框內(nèi)缺失。

1.3.2 I4L（OPG080）

I4L是一個(gè)編碼核糖核苷酸還原酶（RR）大亞基蛋白的基因，該蛋白可能參與核苷酸的合成。該基因在非分裂細(xì)胞中的病毒復(fù)制中起作用。RR是高度保守的酶，在三磷酸脫氧核苷（dNTP）合成過程中催化限速步驟；在正痘病毒（包括VACV和MPXV）中，RR編碼R1和R2亞基，可作為抗病毒靶點(diǎn)。在MPXVⅠB進(jìn)化支中I4L有兩個(gè)一致的同義突變（T372和T31），三個(gè)氨基酸替換（A685P，R358G和G260S）。

1.3.3 L6R（OPG105）

L6R（OPG105）基因編碼RNA聚合酶亞基（RPO147），在猴痘中的作用很少被描述；該基因可能在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄中起作用。分析顯示在MPXVⅠB進(jìn)化支中，該蛋白含有一個(gè)共性移碼突變（P285X），一個(gè)同義突變（A396）和三個(gè)氨基酸替換（V431A，R475C和D506Y）。

1.3.4 A25R（OPG151）

A25R基因編碼RPO132亞基，預(yù)計(jì)該亞基是病毒RNA聚合酶復(fù)合物的一個(gè)組成部分，對(duì)病毒將其DNA復(fù)制成RNA的能力至關(guān)重要。盡管A25R對(duì)MPXV致病性的具體貢獻(xiàn)尚未完全了解，但其在各種MPXV中的高度保守性強(qiáng)調(diào)了其在病毒生命周期中的關(guān)鍵作用。A25R基因位于病毒基因組的核心區(qū)中心，與其他正痘病毒的序列同源性超過90%，這進(jìn)一步凸顯了其作為藥物靶點(diǎn)的重要性和潛力。需要進(jìn)一步的研究來闡明A25R對(duì)毒力和宿主相互作用的確切貢獻(xiàn)。

1.3.5 A17L（OPG143）

A17L是宿主細(xì)胞進(jìn)入和融合所必需的病毒包膜蛋白。在VACV中，A17L在病毒粒子組裝中起著重要作用，并有助于確定蛋白質(zhì)相互作用、裂解、磷酸化和二硫鍵形成的細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)。A17L被F10激酶磷酸化，是感染后期表達(dá)的VACV的主要跨膜組分。盡管該基因尚未在MPXV中明確描述，考慮到它在研究樣本中高度保守，它可能增強(qiáng)了病毒的進(jìn)入和感染。在MPXVⅠB進(jìn)化支中，該蛋白包含兩個(gè)一致的同義突變（E110和R127）和三個(gè)氨基酸替換（A289T，V304A，V322A）。

1.3.6 C7L（OPG045）

C7L基因在MPXV中的作用類似于F1L基因在VACV中的作用。在VACV中，F(xiàn)1L作為細(xì)胞凋亡抑制劑，通過與促凋亡的Bcl-2家族蛋白Bak和Bax結(jié)合，幫助病毒逃避宿主的先天免疫防御。這些蛋白是線粒體膜完整性和細(xì)胞色素C釋放的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。F1L還能抑制caspase-9和NLRP1炎性體，從而增強(qiáng)病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和存活。雖然直接研究C7L在MPXV中作用的具體研究并不普遍，但考慮到正痘病毒家族成員之間的遺傳和功能相似性，推斷C7L可能在MPXV中發(fā)揮類似的作用。該基因可能會(huì)抑制免疫反應(yīng)，增強(qiáng)病毒在宿主內(nèi)的存活和傳播。

1.3.7 A28L（OPG153）

A28L編碼P4c前體蛋白，參與宿主的細(xì)胞進(jìn)入和退出過程。該基因顯示出很高的保留率，這表明它在病毒的生命周期中起著至關(guān)重要的作用，并有可能成為疫苗開發(fā)的目標(biāo)。在最近的一項(xiàng)研究中，從A28L蛋白中鑒定了大量的表位，并提出了多表位候選疫苗，表明其免疫原性潛力。對(duì)這些表位的分析表明，它們可以引起體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，是一種潛在的MPXV免疫原性結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)補(bǔ)充方案。在ⅠB進(jìn)化支的A28L中觀察到7個(gè)殘基移碼缺失（DDDDDII367-373-）、移碼突變（D384X、D386X和DD386-387X）和兩個(gè)氨基酸取代。

1.4 早前的研究熱點(diǎn)蛋白

A29L、A35R、B6R、M1R等是早前猴痘研究中比較熱點(diǎn)的位置。在MPXVⅠB進(jìn)化支中，A29L（OPG154）、A35R（OPG161）這兩個(gè)蛋白的基因未發(fā)生突變，而B6R（OPG190）和M1R（OPG095）上發(fā)生了同義突變。

2.高度分化對(duì)分子檢測(cè)的影響

MPXVⅠ進(jìn)化支和Ⅱ進(jìn)化支之間的序列相似度> 99%，與其他正痘病毒相似度> 90%，這為進(jìn)化支特異性靶序列的開發(fā)帶來了極大的挑戰(zhàn)。美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC）針對(duì)不同的進(jìn)化支推薦了相應(yīng)的引物：MPXV通用（G2R_G）、Ⅰ進(jìn)化支（C3L）和Ⅱ進(jìn)化支（G2R_WA）。新報(bào)道的MPXVⅠb進(jìn)化支的基因組分析顯示，Ⅰ進(jìn)化支MPXV的靶序列（在C3L基因內(nèi)）缺失，這種缺失將影響MPXV進(jìn)化支檢測(cè)的準(zhǔn)確性（取決于所使用的檢測(cè)方法），導(dǎo)致新型Ⅰb進(jìn)化支菌株的假陰性結(jié)果，這可能影響對(duì)Ⅰb進(jìn)化支病毒的傳播監(jiān)測(cè)和防控，特別是在目前流行的MPXVⅡb進(jìn)化支（溫和病毒）存在的情況下[2]。

Ⅰb進(jìn)化支的PCR檢測(cè)方法

鑒于MPXVⅠb進(jìn)化支靶序列（在C3L基因內(nèi)）缺失，最近有研究人員開發(fā)了一種新的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)（dD14-16）專門用于檢測(cè)MPXVⅠb進(jìn)化支，并且可以與其他基于Taqman的檢測(cè)方法一起用于MPXV檢測(cè)區(qū)分。但由于實(shí)驗(yàn)的MPXV DNA剩余不足，未進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，該方法有效性還有待進(jìn)一步證實(shí)。

圖2. MPXV特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

注：dD14-16檢測(cè)采用具有一個(gè)5'-報(bào)告分子（FAM）和一個(gè)3'-猝滅分子（BHQ1）的探針，即5'-FAM-ATATTCAGGCGCATATCCACCCACGT-BHQ-3'，正向引物5'-AAGACTTCCAAACTTAATCACTCCT-3'，反向引物5'-CGTTTGATATAGGATGTGGACAT TT-3'。MPXV_CladeIb_1L/2L/3L/4L/7O/9L是Masirika等人首次描述的Ⅰb進(jìn)化支序列。圖A中MPXV通用引物和探針在Ⅱa進(jìn)化支和Ⅱb進(jìn)化支中存在正向和反向引物不匹配（彩色）。圖B中Ⅰ進(jìn)化支的CDC引物和探針在Ⅰb進(jìn)化支中缺失，僅在Ⅰ進(jìn)化支中存在。圖C中新的正向和反向引物和探針，跨越Ⅰb進(jìn)化支序列缺失的上下區(qū)域。與先前描述的Ⅰ分支序列（如序號(hào)7（MPXV_Clade1_DQ011155））相比，缺失1140 bp。

參考文獻(xiàn)

[1]Masirika LM, Kumar A, Dutt M, et al. Complete Genome Sequencing, Annotation, and Mutational Profiling of the Novel Clade I Human Mpox Virus, Kamituga Strain. J Infect Dev Ctries[J]. 2024,18(4):600-608.
[2]Schuele L, Masirika LM, Udahemuka JC,et al. Real-time PCR assay to detect the novel Clade Ib monkeypox virus, September 2023 to May 2024. Euro Surveill[J].2024,29(32):2400486.

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