糖化血紅蛋白（HbA1c）的檢測方法

全球糖尿病（DM）患病率很高，是嚴重威脅人類健康的世界性公共衛生問題，DM的防治一直是醫學研究的熱點。傳統的DM診斷和治療檢測采用空腹血糖（FBG）、餐后血糖（OBG）和口服葡萄糖耐量實驗（OGTT）等，但是血糖參數僅代表抽血時的瞬間血糖水平，而糖化血紅蛋白（GHb）作為反映長期血糖水平的金標準，也是檢測DM治療的重要指標。1985年Allen等報告用陽離子交換層析儀把人類HbA分離成至少3種比HbA帶更多陰電荷的較小成分，按照從柱中洗滌出來的順序先后把它們分別稱為HbA1a、HbA1b和HbA1c。但當時并沒有發現這些成分與DM之間的關系。直到1975年，人們才逐漸認識到HbA1c來源于葡萄糖結合經翻譯修飾后的HbA，以及HbA1c與FBG、葡萄糖耐量試驗中的葡萄糖峰值以及曲線下面積、過去數周的平均血糖水平等之間的密切關系。

臨床實驗室常用的HbA1c分析方法分為兩大類：一類基于HbA1c和非HbA1c所帶的電荷不同，包括陽離子交換層析法。電泳法和等電位聚焦法；另一類基于GHb基團結構不同，包括親和層析法和免疫學方法。

1. 乳膠凝集反應法

乳膠凝集反應法是利用糖化血紅蛋白（HbA1c）抗原與HbA1c抗體直接測定總血紅蛋白Hb中的糖化血紅蛋白（HbA1c）的百分含量。目前國內外幾家廠商可以提供HbA1c測定的試劑盒。這種免疫反應是由被測血樣品種的總Hb和HbA1c與試劑中的HbA1c抗體結合而形成凝集，凝集量隨HbA1c蛋白濃度的大小而變化。用生物分析儀器來進行比濁測定HbA1c抗原的濃度，采用終點法，生化儀通過測定反應液的吸光度值，可直接反映出凝集量的多少；推算出HbA1c占Hb的百分含量，測定時，儀器多采用660nm單色光做主波長，800nm單色光做副波長，通過標準曲線得出實測值。由于這種試驗其標準曲線是非線性的，所以在測定前，首先用隨試劑盒一起帶有的5種不同濃度的定標液，做出5點非線性標準曲線。曲線和數值存在生化儀的貯存器中，測定樣品時，實測出的吸光度值A與標準曲線比較，由儀器CPU求出實測樣品中的HbA1c百分含量。乳膠凝集反應法測定HbA1c方便、不用增加儀器，可直接用自動生化分析對樣品進行快速測定。該方法也可以用手工的方法，在酶標儀進行測定，是目前使用較多的方法。但乳膠凝集反應法其準確性和重復性均有欠缺。

2. 離子交換高壓液相色譜法HPLC

使用離子交換高壓液相色譜HPLC（high pressure liquid chromatography）來測定糖化血紅蛋白（HbA1c）的百分含量目前被認為是分析HbA1c的金標準。采用HPLC方法工作的全自動糖化血紅蛋白分析儀器，儀器快速、簡便、精巧、準確等特點，受到越來越多用戶的歡迎。

色譜分析是一類利用混合物的各組分在不同相上的分配差別，在兩相物質相對運動過程中，將混合物中的各種成分分離開的一種分析技術。液相色譜是以液體或固體為固定相，以液體為液相的色譜法的總稱。色譜法又叫色層或層析，這一技術在生命科學研究中用于生物活性物質的分析；生物活性物質是以混合物形式存在，人類血液中的蛋白質有上千種，只有把混在一起的被測蛋白分離出來，才能準確測定；在HbA1c的測定時，可以通過高精度HPLC，將HbA1c從Hb中分離出來，才能得到準確的數值。在生命科學研究中，活性物質的分離主要應用的是液相色譜。

3. 糖化血紅蛋白自動分析儀

糖化血紅蛋白自動分析儀采用離子交換HPLC法測定糖化血紅蛋白（HbA1c）。離子交換HPLC法，是利用能交換離子的材料為固定相來分離離子型化合物的方法。儀器使用陽離子交換柱進行HbA1c的百分比測定；當一定量的全血樣品被取樣針吸入到進樣裝置內，在稀釋部分被溶血釋放出紅細胞中的血紅蛋白Hb，并由稀釋液稀釋，稀釋好的已經溶血的樣品，由高壓泵注入離子交換柱。柱內的固定相是最新研發的非多孔性、不溶和可滲透的交聯高聚物，上面分布固定的帶電荷基團和能游走的配衡離子；樣品通過過濾器從交換柱頂端加入后，由三種不同濃度的鹽洗脫緩沖液（流動相）洗脫，使樣品向下移動。此時溶液中所含血紅蛋白Hb的各種組分即與固定相上能移動的離子進行交換，樣品中的血紅蛋白多種組分在固定相上連續進行可逆的交換吸附和解吸作用，而3種不同離子濃度的鹽液，形成線性梯度洗脫。全自動血紅蛋白分析儀能在1分多鐘內，將Hb中的多種成分分離，其中HbA1c、HbF、HbA1被有效、精確的分離；由交換柱流出的Hb成分到達儀器的檢測器，檢測器內裝有發射單色光的發光二極管，通過雙波長可見光比色法測定HbA1c、HbF、HbA1三個參數。儀器的檢測器檢測出分離后HbA1c、HbF、HbA1組分的吸光度值，與HbA1c標準品吸光度值比較，分析計算出結果，最后以百分率表示的Hb組分結果與色譜圖一起打印出來。

離子交換柱HPLC法對全血直接測定HbA1c，其批內和批間變異系數CV均可以小于1%，結果精確，HbA1c檢測結果不受存在的變異型血紅蛋白及其衍生物的影響，特別適合糖尿病人的監控。

4. 金標免疫滲濾法(金標法) 免疫滲濾法

操作較簡便, 目前代表儀器有挪威NycoCardReaderII特種蛋白多功能全定量金標檢測儀。

5. 化學發光法

采用離子捕捉免疫分析法, 應用HbA1c抗原與HbA1c抗體反應原理, 聯以熒光標記物, 通過連接帶負電的多陰離子復合物, 吸附到帶正電的纖維表面, 經過一系列徹底清洗等步驟后, 測定熒光強度變化率, 計算濃度。采用專用試劑包和免疫發光分析儀,其檢測系統易于規范和重復, 可減少操作技術誤差, 檢測的靈敏度和特異性高, 批內、批間變異系數小, 回收率高, 準確度高, 交叉污染率小, 影響因素少。

6. 放射免疫法

優點: 精密度高、特異性強、快速、價格相對便宜, 可批量測試, 且不受各種干擾因素的影響。缺點: 目前對制備高效價的抗體尚存在許多困難, 仍處于研究中, 未能形成商品化試劑盒。

HbA1c的特點

與血糖值相平行

血糖越高，糖化血紅蛋白就越高，所以能反映出血糖的控制水平。

生成緩慢

血糖是不斷波動的，容易受到進食和糖代謝等相關因素的影響，每次抽血檢測結果只能反映當時血糖的水平。由于糖化血紅蛋白是逐漸生成的，短暫的血糖升高（降低）不會引起糖化血紅蛋白的升高（降低），并且不受是否空腹、抽血時間、是否使用胰島素等因素影響，所以更能可靠地反映體內血糖水平。

生成后不易分解

糖化血紅蛋白非常穩定，不易分解，所以它雖然不能反映短時間內的血糖波動，卻能更好的反映較長時間的血糖控制效果，能反映采血前2~3個月內的平均血糖水平。

較少受血紅蛋白水平影響

糖化血紅蛋白是指其在總血紅蛋白中的比例，所以不受血紅蛋白水平的影響。